کیت پروتئین در ادرار و مایع مغز نخاع (روش پیروگالول) – بهار افشان

 

مقدمه

مایع مغزی-نخاعی (Cerebrospinal Fluid – CSF) یک مایع شفاف است که در دستگاه عصبی مرکزی (CNS) و در اطراف مغز و نخاع جریان دارد. افزایش یا کاهش مقدار پروتئین در CSF اغلب نشان‌دهنده وجود اختلال در دستگاه عصبی مرکزی است.

وجود کمترین مقدار پروتئین در ادرار طبیعی است. با این حال، افزایش دفع پروتئین در ادرار به نام پروتئینوری (Proteinuria) شناخته می‌شود و می‌تواند نشانه‌ای از وجود مشکلات و اختلالات در عملکرد کلیه‌ها یا بیماری‌های سیستمیک باشد. سنجش پروتئین در ادرار یکی از آزمایشات تشخیصی مهم در علم علوم آزمایشگاهی و کلینیکی است که به شناسایی و پیگیری علل زمینه‌ای بیماری کمک می‌کند.

---

پروتئین در CSF چیست؟

مایع مغزی-نخاعی (Cerebrospinal Fluid – CSF) یک مایع شفاف است که در دستگاه عصبی مرکزی (CNS) و در اطراف مغز و نخاع جریان دارد. این مایع نقش محافظتی، تغذیه‌ای و حذف مواد زائد از CNS را به عهده دارد. وجود پروتئین‌ها در CSF نشان‌دهنده وضعیت فیزیولوژیک یا وجود پاتولوژی در سیستم عصبی مرکزی است.

مقدار طبیعی پروتئین در CSF: مقدار طبیعی پروتئین در CSF بسته به آزمایشگاه و روش اندازه‌گیری کمی متغیر است، اما به طور کلی:

در افراد بالغ: ۱۵-۴۵ میلی‌گرم در ۱۰۰ میلی‌لیتر

در نوزادان و کودکان: تا ۸۰ میلی‌گرم در ۱۰۰ میلی‌لیتر

اجزای پروتئین‌های CSF: عمده پروتئین‌های موجود در CSF شامل آلبومین، گلوبولین، و برخی پروتئین‌های اختصاصی CNS مانند پروتئین‌های مرتبط با میلین و انتقال‌دهنده‌های غشائی هستند.

اهمیت سنجش پروتئین در CSF

نقش در تشخیص بیماری‌ها

افزایش یا کاهش مقدار پروتئین در CSF اغلب نشان‌دهنده وجود اختلال در دستگاه عصبی مرکزی است. برخی از بیماری‌هایی که می‌توانند با تغییرات سطح پروتئین همراه باشند، عبارتند از:

افزایش پروتئین (Hyperproteinemia)

ممکن است به دلیل:

عفونت‌های CNS: مانند مننژیت باکتریایی یا ویروسی، آبسه مغزی.

التهاب مغز یا نخاع: مانند مالتیپل اسکلروزیس (MS)، آنسفالیت.

انسداد در جریان CSF: مانند تومورهای مغزی، هیدروسفالی، یا آسیب‌های شدید نخاعی.

خونریزی‌های تحت عنکبوتیه یا داخل مغزی که پروتئین‌های خونی به CSF وارد می‌شوند.

 

کاهش پروتئین (Hypoproteinemia)

معمولاً کمتر دیده شده و ممکن است به دلیل نشت CSF (مانند فیستول یا سوراخ شدن نخاع) باشد.

ارزیابی سد خونی-مغزی (Blood-Brain Barrier – BBB)

افزایش غیرطبیعی آلبومین CSF نسبت به سرم نشان‌دهنده اختلال در کارکرد سد خونی-مغزی است.

روش‌های سنجش پروتئین در CSF

پروتئین‌های موجود در CSF معمولاً با روش‌های مختلفی سنجیده می‌شوند. یکی از روش‌های رایج و ساده در آزمایشگاه، استفاده از روش پیروگالول (Pyrogallol Red) است.

---

پروتئین در ادرار

پروتئین‌های ادراری عمدتاً شامل:

آلبومین: فراوان‌ترین پروتئین در ادرار که از پلاسما نشت می‌کند و افزایش آن معمولاً با آسیب در فیلتر گلومرولی کلیه ارتباط دارد.

پروتئین‌های با وزن مولکولی کم: از جمله پروتئین‌های زنجیره سبک ایمنوگلوبولین (مانند بنس-جونز) در موارد مالتیپل میلوما و بتا-۲-میکروگلوبولین (β2-microglobulin) که بیانگر آسیب لوله‌ای کلیه است.

پروتئین‌های تام-هورسفال (Tamm-Horsfall protein): که در لوله‌های دیستال کلیه تولید می‌شوند و درمانی محسوب نمی‌شوند.

ارزش سنجش پروتئین در ادرار

تشخیص اولیه اختلالات کلیوی

سنجش پروتئین در ادرار به شناسایی آسیب‌های اولیه یا قابل توجه گلومرولی و لوله‌ای کلیه کمک می‌کند.

پروتئینوری گلومرولی: افزایش پروتئین ادرار، به‌ویژه آلبومین، اغلب ناشی از اختلال در عملکرد سد گلومرولی کلیه است. این مشکل معمولاً به شکل نشت این پروتئین‌ها به ادرار مشاهده می‌شود. عواملی مانند:

– گلومرولونفریت

-بیماری نفروتیک (سندرم نفروتیک)، با افزایش شدید پروتئین در ادرار همراه است (به طور معمول >3.5 گرم در روز).

پروتئینوری لوله‌ای: مشاهده پروتئین‌های کوچک با وزن مولکولی کم (مانند β2-میکروگلوبولین) می‌تواند نشان‌دهنده آسیب به لوله‌های کلیوی باشد، که عامل آن می‌تواند مسمومیت‌های دارویی، عفونت‌ها، یا بیماری‌های سیستمیک باشد.

تشخیص هرگونه بیماری سیستمی مؤثر بر کلیه

دیابت: سنجش پروتئین (به ویژه آلبومینوری) در بیماران دیابتی برای تشخیص نفروپاتی دیابتی بسیار حیاتی است. میکروآلبومینوری یکی از نشانه‌های اولیه آسیب کلیوی در دیابت است.

فشارخون بالا (Hypertension): پروتئینوری مکرراً در بیماران مبتلا به فشار خون بالا دیده می‌شود و می‌تواند یکی از نشانه‌های اولیه آسیب کلیوی باشد.

تشخیص بیماری‌های سیستمیک دیگر

بیماری‌های خودایمنی: مثل لوپوس منتشر (SLE) می‌تواند باعث پروتئینوری شدید شود که از آسیب کلیوی نشات می‌گیرد (نفریت لوپوسی).

بیماری‌های خونی و بدخیمی: مشاهده پروتئین زنجیره سبک بنس-جونز می‌تواند در تشخیص مالتیپل میلوما به کار رود. همچنین کم خونی سیکل سل ممکن است سبب پروتئینوری شود.

غربالگری در بارداری

در دوران بارداری، پروتئینوری می‌تواند نشانه‌ای از پره‌اکلامپسی یا اکلامپسی باشد. اندازه‌گیری پروتئین در زنان باردار بسیار مهم است، زیرا این وضعیت‌ها برای مادر و جنین خطرناک هستند.

پیگیری اثر بخشی درمان بیماری‌های کلیوی

در بیماران مبتلا به بیماری‌های کلیوی مزمن، کاهش تدریجی پروتئینوری پس از درمان می‌تواند نشان‌دهنده موفقیت درمانی باشد.

روش‌های سنجش پروتئین در ادرار

آزمون کیفی

استفاده از نوارهای کاغذی (Dipstick): این یک روش سریع و ساده برای تشخیص پروتئین در ادرار است. این روش بیشتر برای تشخیص پروتئین آلبومین حساس است تا سایر پروتئین‌ها. تغییر رنگ نشانگر موجود روی نوار (معمولاً سبز تا آبی) مقدار تقریبی پروتئین ادرار (Trace تا 4+) را مشخص می‌کند.

آزمون نیمه‌کمی و کمی

برای بررسی دقیق‌تر و کمی‌سازی میزان پروتئین موجود در ادرار، از روش‌های زیر استفاده می‌شود:

روش پیروگالول رد (Pyrogallol Red): یکی از روش‌های متداول و دقیق برای اندازه‌گیری کمی کل پروتئین ادرار است. بر اساس واکنش پروتئین و پیروگالول رد در محیط خاص که رنگ ایجاد می‌کند و شدت آن با غلظت پروتئین متناسب است.

روش تری کلرو استیک اسید (TCA Precipitation): در این روش، پروتئین‌ها رسوب داده شده و سپس میزان تراکم نوری رسوب‌ها سنجیده می‌شود.

روش بیوره (Biuret Reaction): برای اندازه‌گیری پروتئین‌های ادراری مورد استفاده است، ولی بیشتر برای غلظت‌های بالا کاربرد دارد.

جمع‌آوری ادرار ۲۴ ساعته

• برای تعیین دفع روزانه پروتئین، ادرار طی ۲۴ ساعت جمع‌آوری و سپس غلظت پروتئین در نمونه ترکیبی سنجیده می‌شود.

مقادیر طبیعی و غیرطبیعی پروتئینوری

حالت طبیعی: پروتئین ادرار نباید بیش از ۱۵۰ میلی‌گرم در روز (یا ۱۰-۲۰ میلی‌گرم در دسی‌لیتر در ادرار صبحگاهی) باشد.

میکروآلبومینوری: دفع آلبومین در محدوده ۳۰-۳۰۰ میلی‌گرم در روز. این مقدار معمولاً در مراحل اولیه آسیب‌های کلیوی دیده می‌شود.

ماکروآلبومینوری: دفع آلبومین بیش از ۳۰۰ میلی‌گرم در روز که نشان‌دهنده آسیب کلیوی پیشرفته‌تر است.

نکات بالینی مهم

تست غربالگری اولیه: نوار ادراری (Dipstick) برای غربالگری سریع پروتئینوری مفید است، اما در موارد نیاز به تشخیص دقیق‌تر باید از تست‌های کمی استفاده شود.

سنجش میکروآلبومینوری: سنجش میکروآلبومین ضروری است زیرا افزایش جزئی آلبومین می‌تواند نشان‌دهنده مراحل اولیه آسیب کلیوی باشد.

اثرات فیزیولوژیک: پروتئینوری گذرا ممکن است به دلایل غیر پاتولوژیک مانند ورزش شدید، تب، یا استرس دیده شود. در این موارد، پروتئینوری معمولاً موقت است و به مرور زمان برطرف می‌شود.

---

روش‌های سنجش پروتئین در ادرار و CSF

روش‌های کیفی (Qualitative Methods)

این روش‌ها به طور کلی حضور یا عدم حضور پروتئین را بررسی می‌کنند:

نوار ادراری (Dipstick):

مکانیسم: بر اساس تغییر رنگ یک معرف شیمیایی حساس به آلبومین در نوار ادراری عمل می‌کند.

کاربرد: برای غربالگری اولیه وجود پروتئین در ادرار.

مزایا: ساده و سریع (چند ثانیه زمان می‌برد) بوده و نیازی به تجهیزات پیشرفته ندارد.

معایب: بیشتر به آلبومین حساس است و سایر پروتئین‌ها را با دقت کافی تشخیص نمی‌دهد. ممکن است در مواردی نتایج کاذب مثبت یا کاذب منفی بدهد (مانند تغییر pH یا تراکم زیاد ادرار).

روش جوشاندن (Heat Precipitation Test):

مکانیسم: نمونه ادرار در دمای بالا حرارت داده می‌شود. پروتئین‌های موجود (مانند آلبومین) رسوب می‌کنند و به صورت کدورت یا لخته دیده می‌شوند.

کاربرد: برای بررسی سریع وجود پروتئین بدون تجهیزات خاص.

معایب: نمی‌تواند مقدار دقیق پروتئین را مشخص کند. ممکن است در ادرار غلیظ یا حاوی مواد آلوده دچار خطا شود.

 

روش‌های نیمه‌کمی (Semi-Quantitative Methods)

اندازه‌گیری با روش اسید سولفوسالیسیک (Sulfosalicylic Acid Test):

مکانیسم: اسید سولفوسالیسیک افزایش غلظت پروتئین‌ها را رسوب می‌دهد و نمونه را کدر می‌کند.

مزایا: روش آسان برای شناسایی پروتئین‌ها، به خصوص زمانی که نوار ادراری محدودیت دارد و قادر به تشخیص انواع پروتئین است.

معایب: تغییر کدورت ممکن است به درستی حجم پروتئین را نشان ندهد و نیاز به اندازه‌گیری‌های دقیق‌تر باشد.

نوارهای پیشرفته برای تشخیص میکروآلبومین (Microalbuminuria Tests):

این نوارها برای سنجش مقادیر اندک میکروآلبومین در ادرار دیابتی‌ها یا افراد در خطر بروز مشکلات کلیوی مناسب هستند.

روش‌های کمی (Quantitative Methods)

این روش‌ها قابلیت سنجش دقیق غلظت پروتئین در نمونه را دارند و به طور گسترده در آزمایشگاه‌های پیشرفته استفاده می‌شوند:

روش اسپکتروفتومتری (Spectrophotometric Methods):

رایج‌ترین روش‌ها شامل:

روش پیروگالول رد (Pyrogallol Red):

مکانیسم: ترکیب پروتئین‌ها با معرف پیروگالول رد در حضور مولیبدات سدیم باعث ایجاد رنگ بنفش می‌شود. شدت رنگ متناسب با غلظت پروتئین است و توسط اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۹۰-۶۱۰ نانومتر اندازه‌گیری می‌شود.

مزایا: برای سنجش پروتئین در CSF و ادرار به دلیل حساسیت بالا مناسب است.

معایب: ممکن است برخی مواد با معرف تداخل کنند.

 

روش بیوره (Biuret Assay):

مکانیسم: معرف بیوره با گروه‌های آمیدی پروتئین‌ها واکنش داده و رنگ بنفش ایجاد می‌کند که شدت آن با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری می‌شود.

مزایا: برای پروتئین‌های بالا مناسب است (مانند پروتئینوری شدید).

معایب: برای غلظت پایین پروتئین مناسب نیست.

روش تری کلرو استیک اسید (TCA Precipitation Assay):

در حضور تری کلرو استیک اسید، پروتئین‌ها رسوب می‌دهند و سپس سنجش انجام می‌شود. روش ساده و با دقت مناسب برای موارد کلی است.

روش ایمونوتوربیدیمتری (Immunoturbidimetric Assay):

مکانیسم: آنتی‌بادی‌های اختصاصی با پروتئین‌های موجود ترکیب شده و کدورت ایجاد می‌کنند. میزان کدورت به کمک اسپکتروفتومتر سنجیده می‌شود.

مزایا: برای میکروآلبومینوری و سایر پروتئین‌های خاص بسیار حساس است.

آنالیز پروتئین با کروماتوگرافی (Chromatographic Methods):

روش‌های پیشرفته مانند HPLC برای شناسایی و کمی‌سازی دقیق پروتئین‌های خاص در CSF به‌کار می‌روند.

الکتروفورز پروتئین (Protein Electrophoresis)

الکتروفورز در ادرار

کاربرد: برای تفکیک نوع پروتئین‌ها (مانند تشخیص مولکول‌های بنس جونز).

مزایا: تشخیص دقیق نوع پروتئین موجود.

معایب: روش پیچیده‌ای است و به تجهیزات پیشرفته نیاز دارد.

الکتروفورز در CSF

کاربرد: جهت افتراق پروتئین‌های خاص CNS مانند نوارهای الیگوکلونال (Oligoclonal bands) که در بیماری‌هایی مانند مولتیپل اسکلروزیس (MS) دیده می‌شوند.

سنجش پروتئین با جمع‌آوری ۲۴ ساعته

جمع‌آوری ادرار: برای به دست آوردن مقدار دقیق پروتئین دفع شده در طول روز، ادرار طی ۲۴ ساعت جمع‌آوری شده و سپس مقدار پروتئین کل اندازه‌گیری می‌شود.

کاربرد: می‌تواند اطلاعات دقیقی از وضعیت دفع پروتئینوری ارائه دهد.

مقایسه روش‌ها

روش	زمان مورد نیاز	حساسیت	کاربرد
نوار ادراری	بسیار سریع	متوسط	غربالگری اولیه
پیروگالول رد	سریع	بسیار بالا	پروتئین کم در ادرار و CSF
بیوره	متوسط	متوسط تا بالا	پروتئین زیاد
ایمونوتوربیدیمتری	سریع	بسیار بالا	میکروآلبومینوری
الکتروفورز	طولانی	بسیار بالا	تشخیص دقیق انواع پروتئین‌ها

---

روش پیروگالول برای اندازه‌گیری پروتئین

تعریف و اصول روش

روش پیروگالول (Pyrogallol Red-Molybdate Assay) یک روش رنگ‌سنجی (Colorimetric) است که برای اندازه‌گیری کمی پروتئین‌های موجود در مایعات بیولوژیک از جمله CSF به کار می‌رود. این تست بر اساس واکنش پروتئین‌ها با پیروگالول رد (Pyrogallol Red) در حضور مولیبدات سدیم عمل می‌کند و یک کمپلکس رنگی قابل اندازه‌گیری تولید می‌کند.

مکانیسم واکنش

پیروگالول رد به عنوان معرف اصلی، در حضور مولیبدات سدیم با پروتئین‌ها وارد واکنش شده و کمپلکس‌هایی به رنگ بنفش تولید می‌کند. شدت رنگ بنفش تولیدشده متناسب با غلظت پروتئین در نمونه است. تغییر تراکم نوری (OD) کمپلکس با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر معمولاً در طول موج ۶۰۰ نانومتر اندازه‌گیری می‌شود.

مزایای روش پیروگالول رد

حساسیت بالا: برای اندازه‌گیری مقادیر بسیار کم پروتئین در CSF و ادرار مناسب است.

ساده و سریع: واکنش سریع و آماده‌سازی آسان نمونه و معرف‌ها.

پایداری رنگ: کمپلکس‌های رنگی نسبتاً پایدار هستند که تکرارپذیری آزمایش را افزایش می‌دهد.

استفاده گسترده: علاوه بر CSF، در اندازه‌گیری پروتئین ادرار و سایر مایعات بدن نیز استفاده می‌شود.

نحوه انجام آزمایش با روش پیروگالول

آماده‌سازی محلول استاندارد: معمولاً آلبومین انسانی برای تهیه محلول استاندارد پروتئین در غلظت‌های مشخص استفاده می‌شود.

افزودن معرف (Reagent): مقدار مشخصی از معرف پیروگالول به نمونه CSF یا ادرار اضافه می‌شود.

ایجاد کمپلکس: نمونه و معرف در زمان مناسب (چند دقیقه) و در دمای اتاق واکنش می‌دهند.

اندازه‌گیری جذب نوری: شدت رنگ تولید‌شده در طول موج مشخص (معمولاً ۵۹۰-۶۱۰ نانومتر) به وسیله اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری می‌شود.

محاسبه نتایج: غلظت پروتئین نمونه با استفاده از منحنی کالیبراسیون استاندارد محاسبه می‌شود.

کاربرد کیت‌های پیروگالول رد

کیت‌های آماده Pyrogallol Red برای اندازه‌گیری پروتئین در CSF و سایر مایعات بیولوژیک مانند ادرار، سرم یا آسیت موجود هستند. برخی از شرکت‌های معتبر تولیدکننده این کیت‌ها شامل Roche، Sigma-Aldrich و Randox هستند.

محدودیت‌ها و نکات روش پیروگالول

1. تداخل با مواد خارجی: برخی داروها یا مواد شیمیایی ممکن است با رنگ واکنش داده و نتایج را تغییر دهند.
2. حساسیت به غلظت کم: مقدار بسیار پایین پروتئین (در محدودۀ نرمال) ممکن است به درستی تشخیص داده نشود.
3. نیاز به دستگاه اسپکتروفتومتر: انجام آزمایش مستلزم دسترسی به دستگاه مناسب است.

 

جمع‌بندی

سنجش پروتئین در مایع مغزی-نخاعی (CSF) یکی از تست‌های حیاتی در تشخیص پاتولوژی‌های سیستم عصبی مرکزی است. این آزمایش در کنار سایر روش‌های تشخیصی، به شناسایی بیماری‌هایی مانند مننژیت، تومورها، خونریزی‌های مغزی و اختلالات میلین‌سازی کمک می‌کند.
روش پیروگالول به عنوان یک روش ساده، سریع و قابل اعتماد، در بسیاری از آزمایشگاه‌ها به منظور سنجش پروتئین در CSF استفاده می‌شود. توجه به تداخلات احتمالی و نگهداری صحیح نمونه و معرف، از نکات ضروری برای افزایش دقت این آزمایش است.

اندازه‌گیری پروتئین در ادرار یکی از ابزارهای ارزشمند در تشخیص، پایش و پیگیری بیماری‌های کلیوی و مشکلات سیستمیک دیگر است. این آزمایش می‌تواند آسیب‌های گلومرولی یا لوله‌ای کلیه را در مراحل ابتدایی شناسایی کند و در مدیریت بیماری‌هایی مانند دیابت، فشار خون بالا و بیماری‌های خودایمن نقش حیاتی ایفا کند. انتخاب روش مناسب سنجش، بسته به شرایط بیمار و اهداف تشخیصی، امری کلیدی در آزمایشگاه پزشکی به شمار می‌رود.