محلول همولیزان الکتروفورز – بهار افشان

مقدمه

در تکنیک‌های الکتروفورز هموگلوبین، محلول همولیزان (Hemolysing solution) به‌طور ویژه برای تخریب غشای گلبول‌های قرمز و استخراج محتویات سیتوپلاسمی آن، به‌ویژه هموگلوبین، استفاده می‌شود. این مرحله برای آماده‌سازی نمونه جهت انجام تفکیک هموگلوبین‌های مختلف (مانند Hgb A، Hgb F، Hgb S و Hgb C) ضروری است. محلول همولیزان باعث لیز کردن گلبول‌های قرمز خون (RBCs)، آزادسازی هموگلوبین و آماده کردن آن برای تحلیل در روش‌های الکتروفورز می‌شود.

ترکیبات محلول همولیزان

محلول همولیزان شامل موادی است که به طور خاص برای تخریب غشای سلولی و ایجاد محیط مناسب برای آزادسازی هموگلوبین طراحی شده‌اند. ترکیبات معمول عبارتند از:

دترجنت‌های ملایم: موادی مانند سورفکتانت‌های غیر یونی (Non-ionic detergents) یا دترجنت‌های خنثی به‌شکل ملایمی غشای گلبول‌های قرمز را می‌شکنند تا محتویات آنها (از جمله هموگلوبین) آزاد شود.

محلول بافر مناسب: معمولاً از یک بافر فسفات یا بافر مشابه برای حفظ pH مناسب استفاده می‌شود. pH محلول معمولاً در حدود خنثی یا کمی قلیایی (7 تا 8) تنظیم می‌شود.

نمک‌های پایدارکننده: موادی مانند کلرید سدیم (NaCl) یا EDTA برای پایدارسازی هموگلوبین و جلوگیری از اکسیداسیون یا دناتوراسیون مولکول‌ها.

آب دیونیزه: به عنوان حلال استفاده شده و برای تنظیم غلظت نهایی تمامی ترکیبات به کار می‌رود.

طرز تهیه یک محلول همولیزان عمومی

یک فرمول رایج برای محلول همولیزان ترکیبی مشابه زیر است:

بافر فسفات: 0.1 مولار (pH = 7.0 تا 7.5)

NaCl: 0.9٪ (برای تنظیم یونیک محیط)

آب مقطر: حجمی به اندازه کل محلول

در برخی پروتکل‌ها ممکن است از دترجنت‌های خفیف مانند Triton X-100 یا Nondenatured Surfactants برای شکستن غشا استفاده شود.

نقش محلول همولیزان در تکنیک الکتروفورز

لیز کردن گلبول‌های قرمز: گلبول‌های قرمز به دلیل وجود غشای دوجداره‌ی فسفولیپیدی مقاوم هستند. محلول همولیزان به شکسته شدن غشای RBCها کمک کرده و محتوای داخل سلولی، به‌ویژه هموگلوبین، را آزاد می‌کند.

حفظ ساختار و پایداری هموگلوبین: هموگلوبین پس از آزادسازی، ممکن است مستعد اکسیداسیون یا دناتوراسیون باشد. محلول همولیزان شرایط مناسب را فراهم می‌کند تا ساختار چهارگانه هموگلوبین پایدار باقی بماند و تفکیک دقیق طی الکتروفورز امکان‌پذیر شود.

ایجاد یک نمونه آماده برای الکتروفورز: پس از همولیز، هموگلوبین محلول به‌صورت آماده در محیط مایع وجود دارد و می‌توان آن را بدون ذرات مزاحم سلولی به ژل الکتروفورز انتقال داد.

جدا کردن هموگلوبین‌های مختلف: کیفیت نمونه هموگلوبین مستقیماً بر روی تفکیک دقیق هموگلوبین‌های مختلف (مانند Hgb A، Hgb F، Hgb S، Hgb C) تأثیر می‌گذارد. بنابراین همولیز مناسب یک گام اساسی در این فرآیند است.

کاربرد محلول همولیزان در آزمایشگاه

محلول همولیزان در موارد زیر کاربرد دارد:

الکتروفورز هموگلوبین

در روش‌های الکتروفورز آگارز، پلی‌اکریل‌آمید یا کاغذ سلولز استات برای جداسازی و تشخیص اختلالات هموگلوبین مانند کم‌خونی داسی‌شکل (Sickle Cell Anemia)، بتا-تالاسمی، یا سایر هموگلوبینوپاتی‌ها.

مطالعات HbA1c (هموگلوبین گلیکوزیله)

تهیه هموگلوبین به‌عنوان نمونه اولیه برای آنالیز HbA1c در بیماران مبتلا به دیابت.

تشخیص هموگلوبینوپاتی‌های وابسته به هموگلوبین جنینی (HbF)

مواردی مانند ارزیابی هموگلوبین جنینی (Hgb F) در بیماری‌هایی مثل تالاسمی ماژور یا اختلالات رشد جنینی.

آزمایش‌های مرتبط با تحرک الکتروفورتیک پروتئین‌ها

مشخص کردن هموگلوبین‌های غیرطبیعی که بار یا ساختار متفاوتی دارند (مانند هموگلوبین H).

مزایای استفاده از محلول همولیزان

سرعت بالا: تخریب گلبول‌های قرمز به صورت سریع و کارآمد انجام می‌شود.

حفظ کیفیت هموگلوبین: مانع از دناتوراسیون هموگلوبین می‌شود و ثبات آن را فراهم می‌کند.

تهیه نمونه تمیز برای تحلیل دقیق: اجازه جدا کردن انواع مختلف هموگلوبین را با حداکثر وضوح ممکن می‌دهد.

کاربرد آسان در چندین تکنیک آزمایشی: از آن برای تکنیک‌های مختلف تشخیصی و بالینی استفاده می‌شود.

چالش‌ها و تداخلات

اگر از محلول به درستی استفاده نشود یا بافر تنظیم نباشد، ممکن است هموگلوبین دناتوره شده و نتایج اشتباه در جداسازی یا تشخیص نوع هموگلوبین به دست آید. باقی‌ماندن بقایای سلولی یا مواد غیرهموگلوبینی ممکن است وضوح باندها را کاهش دهد.

جمع‌بندی

محلول همولیزان یک گام حیاتی در تکنیک‌های الکتروفورز هموگلوبین و تحلیل هموگلوبینوپاتی‌ها است که برای شکستن غشای گلبول‌های قرمز و آزاد کردن هموگلوبین پایدار طراحی شده است. ترکیبات اصلی آن شامل بافرهای مناسب، دترجنت‌ها و نمک‌های پایدارکننده است که هم نمونه را آماده می‌کند و هم کیفیت جداسازی باندهای هموگلوبین را در مراحل بعدی بهبود می‌بخشد.