محلول شفاف کننده الکتروفورز (غلیظ) – بهار افشان

مقدمه

محلول شفاف‌کننده در الکتروفورز به ترکیباتی اطلاق می‌شود که پس از انجام الکتروفورز روی ژل، برای روشن‌تر کردن یا شفاف کردن ژل استفاده می‌شوند. این مرحله در واقع برای افزایش کنتراست و دید واضح‌تر نواحی رنگ‌آمیزی‌شده (مانند باندهای پروتئین یا DNA) در ژل انجام می‌شود. استفاده از محلول شفاف‌کننده به ویژه در رنگ‌آمیزی‌هایی نظیر کوماسی بلو (Coomassie Blue) یا سیلور استینینگ (Silver Staining) اهمیت دارد.

ترکیبات محلول شفاف‌کننده

محلول شفاف‌کننده در الکتروفورز معمولاً از ترکیباتی تشکیل شده است که نقش آن‌ها پاک‌کردن و حذف رنگ یا مواد مزاحم از زمینه (قسمت غیرحاوی آنالیت در ژل) است. ترکیبات معمول این محلول به شرح زیر هستند:

متانول (Methanol): متانول به عنوان حلال عمل می‌کند و رنگ‌های باقی‌مانده در زمینه ژل را حل کرده و از بین می‌برد. غلظت مورد استفاده متانول، معمولاً در حدود ۳۰-۵۰٪ (V/V) استفاده می‌شود.

اسید استیک (Acetic Acid): به رسوب پروتئین‌ها در هنگام رنگ‌آمیزی و کاهش رنگ پس‌زمینه کمک می‌کند. از این اسید، معمولاً در حدود ۱۰-۲۰٪ (V/V) استفاده می‌شود.

آب مقطر: به عنوان حلال استفاده می‌شود و برای کاهش غلظت حلال‌ها و تنظیم حجم نهایی محلول شفاف‌کننده به کار می‌رود.

عملکرد و مکانیسم اثر محلول شفاف‌کننده

عملکرد محلول شفاف‌کننده به این شکل است:

کاهش رنگ پس‌زمینه: رنگ‌هایی که به طور ضعیفی به نواحی غیرپروتئینی یا غیرهدف در ژل متصل شده‌اند، توسط متانول یا اسید استیک حل شده و از ژل حذف می‌شوند.

افزایش وضوح باندها: پروتئین‌ها یا DNA که به رنگ خاصی متصل شده‌اند، به صورت باندهای مشخص با کنتراست بالا در ژل ظاهر می‌شوند، زیرا تمام رنگ‌های اضافی پس‌زمینه توسط محلول شفاف‌کننده پاک می‌شوند.

کاربردهای محلول شفاف‌کننده در الکتروفورز

آشکارسازی باندها در رنگ‌آمیزی با کوماسی بلو (Coomassie Brilliant Blue)

پس از رنگ‌آمیزی پروتئین‌ها در ژل SDS-PAGE با کوماسی بلو، از محلول شفاف‌کننده برای حذف رنگ اضافی از نواحی خالی ژل استفاده می‌شود. این کار باندهای پروتئینی را به وضوح نشان می‌دهد.

رنگ‌آمیزی با سیلور استینینگ (Silver Staining)

در استینینگ نقره که به دقت و حساسیت بالا نیاز دارد، پس‌زمینه باید تا حد امکان شفاف و کم‌رنگ باشد. محلول شفاف‌کننده به کاهش رنگ زمینه و بهبود دید باندها کمک می‌کند.

مطالعه پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک

در ژل‌های آگارز یا پلی‌اکریل‌آمید که برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک (DNA یا RNA) یا پروتئین‌ها استفاده می‌شوند، مرحله شفاف کردن برای واضح‌تر کردن موقعیت باندها در ژل استفاده می‌شود.

بهبود کیفیت تصویر برای ثبت نتایج

شفاف کردن ژل باعث می‌شود که باندها بهتر دیده شوند و این به ثبت عکس یا تحلیل دقیق‌تر نتایج کمک می‌کند.

مزایای استفاده از محلول شفاف‌کننده

افزایش وضوح باندها و کیفیت آنالیز.

کاهش رنگ پس‌زمینه و افزایش خوانایی ژل.

جلوگیری از تداخلات دوره‌ای رنگ‌ها در طول آنالیزهای دیگر.

بهبود عکسبرداری از ژل.