محلول تریپسین – بهار افشان

مقدمه

تریپسین (Trypsin) یک آنزیم پروتئاز است که به خانواده سرین پروتئازها تعلق دارد و توسط سلول‌های پانکراس در بدن ترشح می‌شود. این آنزیم نقش مهمی در هضم پروتئین‌ها به آمینواسیدهای کوچک دارد و به‌طور گسترده‌ای در کشت سلولی برای جدا کردن سلول‌ها از سطح ظرف کشت یا از توده سلولی به‌کار می‌رود.

ویژگی‌های تریپسین

ساختار: تریپسین یک آنزیم محلول است که با شکستن پیوندهای پپتیدی آرژنین و لایزین، پروتئین‌ها را به واحدهای کوچکتر تجزیه می‌کند.

منبع: تریپسین طبیعی از پانکراس گاو (Bovine) یا خوک (Porcine) استخراج می‌شود. تریپسین مصنوعی نیز به صورت تجاری تولید می‌شود و برای کشت سلول مورد استفاده قرار می‌گیرد.

فعالیت مناسب در pH و دما: بهینه فعالیت تریپسین معمولاً بین pH 7.5–8.5 در دمای 37 درجه سانتی‌گراد اتفاق می‌افتد.

کاربردهای تریپسین در کشت سلول

جدا کردن سلول‌ها از سطح ظرف کشت یا توده سلولی

در کشت سلولی، اغلب سلول‌ها به سطح ظرف کشت (مانند ظروف پلاستیکی یا لایه‌های ماتریکسی داخل ظرف) متصل هستند. برای پاساژ دادن سلول‌ها یا انتقال آنها به محیط دیگر، باید این اتصال جدا شود.

تریپسین پروتئین‌های سطحی که باعث چسبندگی سلول‌ها به ظرف هستند را تخریب می‌کند و می‌تواند سلول‌ها را در محیط مایع شناور کند.

کمک به پاساژ دادن سلول‌ها (Subculture)

پس از رسیدن سلول‌ها به حداکثر تراکم رشد (Confluency)، باید سلول‌ها به یک ظرف جدید منتقل شوند یا محیط آنها تغییر کند. تریپسین با جدا کردن سلول‌ها به این فرآیند کمک می‌کند.

جداسازی سلول‌ها در روش‌های طبقه‌بندی و آنالیز

در تکنیک‌هایی مانند فلوسیتومتری یا کشت‌های تک‌سلولی، استفاده از تریپسین برای جداسازی سلول‌ها به صورت تک‌سلول‌های مستقل ضروری است.

کاهش آلودگی توده سلولی

تریپسین، بخش‌های ماتریکس اضافی یا بافتی را حذف کرده و سلول‌ها را برای پردازش بهتر آماده می‌کند.

فرآیندهای حفظ بانک سلولی (Cell Banking)

جداسازی سلول‌ها برای فریز کردن آنها به فرم‌های استاندارد بانک‌های سلولی نیز با استفاده از تریپسین انجام می‌شود.

نحوه استفاده از تریپسین در کشت سلول

مرحله آماده‌سازی سلول‌ها: ابتدا ماده کشت سلولی (مانند DMEM یا RPMI) از ظرف جدا شده و سلول‌ها شسته می‌شوند تا محیط اضافی و پروتئین‌های باقی‌مانده حذف شوند. این کار معمولاً توسط PBS (فسفات بافر سالین) انجام می‌شود.

افزودن تریپسین به ظرف کشت: مقدار کمی از محلول تریپسین (0.25% یا 0.05%) به ظرف اضافه می‌شود و به طور یکنواخت سطح سلول‌ها پوشانده شده و سپس در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌شود.

مدت زمان انکوبه: انکوباسیون معمولاً بین 1 تا 5 دقیقه طول می‌کشد (زمان دقیق بستگی به نوع سلول دارد). سلول‌ها در این مدت از سطح ظرف جدا می‌شوند.

غیرفعال کردن تریپسین: پس از جدا شدن سلول‌ها، محلول تریپسین باید با افزودن فِتال بُواین سِرُم (FBS) یا محیط کشت دارای پروتئین غیرفعال شود. FBS حاوی پروتئین‌های مهاری است که تریپسین را خنثی کرده و مانع تخریب بیش از حد سلول‌ها می‌شوند.

جمع‌آوری سلول‌ها: سلول‌ها سانتریفیوژ شده یا مستقیماً در محیط جدید کشت داده می‌شوند.

نکاتی برای استفاده صحیح از تریپسین

غلظت مناسب: معمولاً غلظت 0.25% یا 0.05% برای سلول‌های چسبنده (Adherent) استفاده می‌شود.

زمان انکوباسیون: زمان بیش از حد انکوباسیون می‌تواند باعث آسیب به سلول‌ها و تغییرات ساختاری پروتئین‌های حیاتی شود.

محیط انکوباسیون: دمای انکوباسیون باید به دمای بدن انسان (37 درجه سانتی‌گراد) نزدیک باشد؛ در غیر این صورت تریپسین فعالیت کافی نخواهد داشت.

خنثی‌سازی تریپسین: عدم غیرفعال‌سازی تریپسین پس از جدا شدن سلول‌ها می‌تواند به پروتئین‌های سطح سلولی آسیب رسانده و اثرات منفی بر روی زنده‌مانی سلول‌ها داشته باشد.

مزایا و محدودیت‌های استفاده از تریپسین در کشت سلولی

مزایا

ساده و سریع: استفاده از تریپسین، یکی از روش‌های آسان برای جداسازی سلول‌ها محسوب می‌شود.

کارایی بالا: امکان پاساژ دادن سلول‌ها به صورت کارآمد در دوره‌های زمانی کوتاه.

حفظ سلامت کلی سلول‌ها: اگر به درستی انجام شود، سلول‌های زیادی زنده مانده و عملکردشان حفظ می‌شود.

محدودیت‌ها

آسیب به پروتئین‌های سطحی: استفاده بیش از حد یا طولانی از تریپسین می‌تواند برخی پروتئین‌های حیاتی سطحی را تخریب کند.

محدودیت در نوع سلول: سلول‌های غیرچسبنده (Suspension cells) یا سلول‌هایی با اتصالات مقاوم ممکن است نیازمند روش‌های جایگزین باشند.

خطر آلودگی: جداسازی با تریپسین نیازمند شرایط کاملاً استریل است تا آلودگی به حداقل برسد.

جایگزین‌های تریپسین در کشت سلولی

برای سلول‌هایی که ممکن است به تریپسین حساس باشند، می‌توان از جایگزین‌های زیر استفاده کرد:

Dispersin: آنزیم‌های مختلف برای جداسازی اختصاصی سلول‌ها.

EDTA: عامل شلات‌کننده برای تخریب اتصالات کلسیم بین سلول‌ها.

Accutase: محلول آنزیمی جایگزین که ملایم‌تر از تریپسین عمل می‌کند.

تکنیک‌های مکانیکی: استفاده از روش‌هایی مانند کشت در ظروف بدون چسبندگی (Non-Adherent).

جمع‌بندی

تریپسین یک ابزار کلیدی در کشت سلولی است که برای جداسازی سلول‌های چسبنده از ظروف کشت مورد استفاده قرار می‌گیرد. این آنزیم با تجزیه پروتئین‌های سطحی، سلول‌ها را جدا کرده و امکان پاساژ دادن یا انتقال آنها به محیط جدید را فراهم می‌سازد. با رعایت اصول صحیح و خنثی‌سازی به‌موقع، تریپسین می‌تواند با حفظ زنده‌مانی و عملکرد سلول‌ها، نقش موثری در تحقیقات زیست‌شناسی سلولی و ایمونولوژی داشته باشد.