فایکول (جداکننده لنفوسیت) – بهار افشان

مقدمه

فایکول (Ficoll) یک پلیمر سنتزی است که به عنوان یک ماده کاربردی در زیست‌شناسی سلولی و ایمونولوژی برای جداسازی سلول‌های خون محیطی (Peripheral Blood Mononuclear Cells یا PBMCs) به کار می‌رود. یکی از کاربردهای اصلی فایکول تهیه‌ی لنفوسیت‌ها (سلول‌های تک هسته‌ای مانند لنفوسیت‌ها و مونوسیت‌ها) از خون کامل است که در تحقیقات بالینی و آزمایشگاه‌های ایمنی‌شناسی بسیار پرکاربرد است.

روش جداسازی با استفاده از گرادیان چگالی فایکول (Ficoll-Paque) انجام می‌شود که تأثیر چگالی متفاوت سلول‌ها بر جداسازی آنها را امکان‌پذیر می‌سازد.

ویژگی‌های فایکول و محلول Ficoll-Paque

فایکول پلی‌ساکارید غیونی‌شده (Uncharged Polysaccharide)

فایکول مولکولی بزرگ و هیدروفیلیک است که قابلیت افتراق چگالی را در ترکیب با مواد دیگر مانند Sephadex فراهم می‌کند.

محلول Ficoll-Paque

ترکیبی است که معمولاً شامل فایکول و دی‌آمیدیزوپروپانول (Diatrozoic Acid) یا ماده دیگری است که چگالی خاصی دارد (حدود 1.077 g/mL). این محلول برای ایجاد گرادیان چگالی طراحی شده است.

مکانیزم جداسازی لنفوسیت‌ها با فایکول

روش فایکول بر اساس تفاوت چگالی سلول‌های خونی عمل می‌کند. سلول‌های خونی انواع مختلفی دارند که هر کدام چگالی متفاوتی دارند:

لنفوسیت‌ها و مونوسیت‌ها (PBMCs): چگالی کمتر از 1.077 g/mL دارند.

نوتروفیل‌ها و گلبول‌های قرمز: چگالی بیشتر از 1.077 g/mL دارند.

محلول فایکول گرادیانی ایجاد می‌کند که بر اساس این تفاوت چگالی، سلول‌ها را جدا کرده و لنفوسیت‌ها را از دیگر سلول‌های خونی تفکیک می‌کند.

مراحل جداسازی لنفوسیت‌ها با فایکول

1-آماده‌سازی نمونه خون

خون محیطی (حدود 5-10 میلی‌لیتر) از بیمار جمع‌آوری شده و با EDTA یا هپارین به عنوان ضد انعقاد مخلوط می‌شود تا مانع لخته شدن خون شود.

2-رقیق کردن خون

خون به نسبت 1:1 با محلول فیزیولوژیک یا PBS (فسفات بافر سالین) رقیق می‌شود. این مرحله باعث می‌شود که لایه‌های سلولی به راحتی از هم جدا شوند.

3-لایه‌گذاری روی محلول فایکول

محلول فایکول در یک لوله سانتریفیوژ ریخته می‌شود. خون رقیق شده به‌آرامی و با احتیاط به بالای لایه فایکول اضافه می‌شود، به طوری که دو لایه مجزا شکل گیرد (لایه خون روی لایه فایکول).

4-سانتریفیوژ

لوله در سانتریفیوژ قرار داده شده و با سرعت حدود 400 تا 800 ×g به مدت 20 تا 30 دقیقه سانتریفیوژ می‌شود. سانتریفیوژ باید در دمای اتاق و بدون ترمز ناگهانی انجام شود.

5-تشکیل لایه‌ها

پس از سانتریفیوژ، سلول‌ها بر اساس چگالی‌شان در لایه‌های مختلف مرتب می‌شوند:

-پلاسما: در لایه فوقانی.

-حلقه PBMCs (لنفوسیت‌ها و مونوسیت‌ها): در مرز بین پلاسما و محلول فایکول (به دلیل چگالی کمتر از فایکول).

-محلول فایکول: در لایه میانی.

-گلبول‌های قرمز و نوتروفیل‌ها: در لایه تحتانی (به دلیل چگالی بیشتر از فایکول).

6-جداسازی لنفوسیت‌ها

حلقه‌ سفیدرنگی که در مرز بین پلاسما و فایکول شکل می‌گیرد، حاوی لنفوسیت‌ها و مونوسیت‌ها است. این لایه با پیپت منتقل شده و به لوله تازه‌ای منتقل می‌شود.

7-شست‌وشوی سلول‌ها

سلول‌های جدا شده با PBS یا محیط کشت شسته می‌شوند (معمولاً از سانتریفیوژ با سرعت حدود 300×g برای این کار استفاده می‌شود) تا فایکول یا آلودگی‌های باقی‌مانده حذف شوند.

8-آماده‌سازی نهایی

پس از شست‌وشو، سلول‌ها در محیط مناسب کشت داده می‌شوند یا برای بررسی‌های آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

کاربردهای جداسازی لنفوسیت‌ها به کمک فایکول

ایمونولوژی

-مطالعه پاسخ ایمنی (مانند بررسی لنفوسیت‌های T و B).

-بررسی عملکرد سلول‌های ایمنی در بیماری‌های خودایمنی و التهابی.

تکنیک‌های مولکولی

-استخراج RNA یا DNA از لنفوسیت‌ها برای بررسی‌های ژنتیکی.

-ایجاد خطوط سلولی یا کشت‌های سلولی از PBMCs.

تشخیص بالینی

-جداسازی و شناسایی لنفوسیت‌ها در شرایط خاص مانند لنفوم، لوکمی یا سایر بیماری‌های خونی.

-بررسی تاثیر داروها روی سلول‌های ایمنی.

پژوهش‌های پیوند

-مطالعه سلول‌های ایمنی مرتبط با پیوند اعضا و کاهش احتمال رد پیوند.

آنالیز سلول‌ها

-بررسی تک‌سلولی یا شمارش انواع خاصی از سلول‌ها با تکنیک‌هایی مثل فلوسیتومتری.

مزایا و معایب روش فایکول

مزایا

راندمان بالا: جداسازی دقیق لنفوسیت‌ها از سایر سلول‌های خونی.

برهم‌کنش پایین: سلول‌ها کمتر دست‌کاری می‌شوند و عملکرد آنها حفظ می‌شود.

روش ساده و مقرون‌به‌صرفه: در مقایسه با سایر روش‌های جداسازی (مانند تکنیک‌های آنتی‌بادی مغناطیسی).

معایب

خطر آلودگی: مونوسیت‌ها، پلاکت‌ها یا نوتروفیل‌ها ممکن است به حلقه PBMCs وارد شوند.

مناسب نبودن برای همه سلول‌ها: برای جداسازی سایر اجزای خونی مانند نوتروفیل‌ها باید از روش‌های دیگری استفاده شود.

نیاز به دقت بالا: در مراحل لایه‌گذاری خون و سانتریفیوژ، دقت بالایی نیاز است.

جمع‌بندی

روش فایکول یکی از پرکاربردترین و معتبرترین روش‌ها برای جداسازی لنفوسیت‌ها و مونوسیت‌ها از خون محیطی است. این روش بر اساس تفاوت چگالی سلول‌ها عمل کرده و امکان تهیه‌ی جمعیت خالصی از سلول‌های PBMC برای کاربردهای تشخیصی، پژوهشی و درمانی را فراهم می‌آورد. با رعایت اصول و دقت در انجام مراحل، می‌توان به نتایج باکیفیت و قابل اعتمادی رسید.