بافر هموگلوبین الکتروفورز – بهار افشان

مقدمه

بافر هموگلوبین در الکتروفورز به عنوان یک محیط کنترل‌شده عمل می‌کند که برای بررسی و جداسازی اشکال مختلف هموگلوبین (مانند هموگلوبین‌های طبیعی و غیرطبیعی) به کار می‌رود. نقش اصلی این بافر تنظیم شرایط محیطی مناسب جهت حفظ پایداری هموگلوبین و تضمین حرکت دقیق و صحیح مولکول‌های هموگلوبین در ژل یا کاغذ در طول الکتروفورز است.

نقش بافر هموگلوبین در الکتروفورز

حفظ pH مناسب: هموگلوبین در شرایط مشخص pH بار الکتریکی خاصی خواهد داشت. بافر هموگلوبین شرایط pH را به گونه‌ای تنظیم می‌کند که هموگلوبین‌ها به طور مؤثری از یکدیگر تفکیک شوند. معمولاً pH مناسب برای الکتروفورز هموگلوبین حدود 8.4 در محیط قلیایی است.

ایجاد محیط یکنواخت برای حرکت مولکول‌ها: بافر مانع از تغییرات محیطی الکتریکی می‌شود و جریان بارهای الکتریکی را تثبیت می‌کند. این امر باعث حرکت یکنواخت هموگلوبین‌ها بر اساس بار الکتریکی و وزن آن‌ها می‌شود.

جلوگیری از تغییر ساختار هموگلوبین: حضور بافر از دناتوره‌شدن هموگلوبین در طول فرآیند الکتروفورز جلوگیری می‌کند و پایداری ساختار چهارگانه هموگلوبین را حفظ می‌کند.

جداسازی هموگلوبین‌های طبیعی و غیرطبیعی: هموگلوبین‌های مختلف (مانند Hgb A، Hgb F، Hgb S، و Hgb C) دارای بارهای متفاوتی در pH معین هستند که با کمک بافر، حرکت هر یک در میدان الکتریکی از یکدیگر تفکیک می‌شود.

ترکیبات بافر هموگلوبین

بافر هموگلوبین معمولاً شامل مواد زیر است:

تریس-گلیسین (Tris-Glycine): تریس (Tris) به عنوان یک تنظیم‌کننده قوی pH در محلول‌های قلیایی عمل می‌کند. گلیسین به کاهش رسانایی کمک می‌کند و یون‌های لازم برای هدایت جریان الکتریکی را فراهم می‌آورد.

غلظت معمول تریس: 0.05 مولار

نسبت پُرکاربرد: تریس 25 میلی‌مولار / گلیسین 192 میلی‌مولار.

EDTA (گاهی): برای جلوگیری از تغییرات ناشی از یون‌های فلزی (مانند یون‌های مس یا آهن) استفاده می‌شود که ممکن است بر ساختار یا بار پروتئین‌ها تأثیر بگذارند.

آب دیونیزه: برای تهیه محلول‌های بافر و تنظیم غلظت استفاده می‌شود.

در برخی روش‌ها: بازدارنده‌هایی نظیر سدیم یا یون‌های خاص: برای جلوگیری از تشکیل کمپلکس ناخواسته و حفظ باندها در فرم باثبات.

کاربردهای بافر هموگلوبین در الکتروفورز

الکتروفورز هموگلوبین در تشخیص بیماری‌ها

برای تشخیص انواع هموگلوبینوپاتی‌ها (مانند آنمی داسی‌شکل، تالاسمی و بیماری Hgb C) استفاده می‌شود. هموگلوبین‌های غیرطبیعی (مانند هموگلوبین S یا C) بار و حرکت متفاوتی نسبت به هموگلوبین طبیعی A نشان می‌دهند و توسط الکتروفورز در حضور بافر قابل جداسازی هستند.

آنالیز ترکیبات هموگلوبین جنینی و بالغ

بررسی نسبت هموگلوبین‌های مختلف، مانند Hgb F (جنینی) و Hgb A (بالغ)، در شرایط بالینی نظیر تالاسمی ماژور یا هموگلوبینوپاتی‌های مختلط.

حفظ کارایی ژل

در تکنیک‌های الکتروفورز ژل آگارز یا سلولز استات، بافر محیط را تنظیم می‌کند تا حرارت یا تغییرات pH به ساختار ژل یا عملکرد آن آسیب نزند.

پروتکل عمومی استفاده از بافر هموگلوبین در الکتروفورز

تهیه محلول بافر: بافر با مخلوط کردن تریس، گلیسین و آب دیونیزه به نسبت مشخص تهیه می‌شود. pH به مقدار 8.4 تنظیم می‌گردد.

آماده‌سازی نمونه: نمونه خون بیمار در شرایط ضدانعقاد جمع‌آوری می‌شود. هموگلوبین از لیز گلبول‌های قرمز استخراج می‌شود.

میدان الکتریکی: نمونه هموگلوبین روی ژل یا کاغذ سلولز استات قرار داده می‌شود و میدان الکتریکی اعمال می‌گردد. بافر اجازه می‌دهد که هموگلوبین‌ها متناسب با بار و وزن مولکولی حرکت کنند.

رنگ‌آمیزی: پس از اتمام الکتروفورز، از روش‌های رنگ‌آمیزی خاص (مانند آردین/آمینوبنزوئیک اسید) برای آشکارسازی باندهای هموگلوبین در ژل استفاده می‌شود.

مزایا و نقش حیاتی بافر هموگلوبین

تضمین دقت جداسازی بین انواع هموگلوبین طبیعی و غیرطبیعی.

حفظ پایداری شیمیایی و ساختاری هموگلوبین در طول فرآیند.

کمک به درک بیماری‌ها و جهش‌هایی که باعث تغییر شکل هموگلوبین می‌شوند.

فراهم کردن محیطی تکرارپذیر برای آزمایش‌های مرتبط با بالین یا پژوهش.

جمع‌بندی

بافر هموگلوبین یکی از اجزای کلیدی در تکنیک‌های الکتروفورز است که وظیفه تنظیم pH، حفظ پایداری هموگلوبین و تضمین حرکت درست مولکول‌ها در میدان الکتریکی را بر عهده دارد. ترکیبات اصلی آن شامل تریس، گلیسین و آب دیونیزه است و برای تشخیص بالینی و پژوهش روی هموگلوبینوپاتی‌ها کاربرد گسترده دارد.